Главная – Журналы – Атеросклероз 2019 номер 2

Цель исследования - оценить, происходит ли интернализация кальций-фосфатных и магний-фосфатных бионов эндотелиальными клетками. Материал и методы. Искусственно синтезированные путем перенасыщения культуральной среды соответствующими солями магний-фосфатные бионы (МФБ), а также сферические и игольчатые кальций-фосфатные бионы (СКФБ и ИКФБ) были добавлены к конфлюэнтным культурам первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека на 4 ч. Для визуализации интернализации бионов эндотелиальные клетки изучали методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в обратнорассеянных электронах и конфокальной микроскопии. Для СЭМ изучаемые клетки были фиксированы в 10%-м забуференном формалине, постфиксированы/окрашены 2%-м тетраоксидом осмия, дегидратированы воздействием спиртов возрастающей концентрации, окрашены 2%-м уранилацетатом, пропитаны смесью ацетона и эпоксидной смолы, заключены в чистую эпоксидную смолу для создания полимеризованных эпоксидных блоков с их последующей шлифовкой и полировкой. Эпоксидные блоки контрастировали цитратом свинца путем нанесения на поверхность шлифованного образца с последующим напылением блоков углеродом и собственно СЭМ. Для анализа интернализации бионов клетками методом конфокальной микроскопии к синтезированным бионам был добавлен меченный флуоресцеинизотиоцианатом альбумин (МФБ) или кальцеин (КФБ) с последующим добавлением к клеточным культурам лизосомального красителя LysoTracker Red и ядерного красителя Hoechst 33342. Результаты. Все изученные виды бионов интернализировались эндотелиальными клетками в течение 4 ч. При СЭМ отчетливо визуализировались множественные черные электронно-плотные минеральные включения в цитоплазме клеток, отсутствующие как внутри контрольных клеток, так и в межклеточном пространстве. Конфокальная микроскопия позволила детектировать интернализированные клетками МФБ и КФБ, которые находились в цитоплазме клеток или были ко-локализованы с лизосомами. Заключение. При помощи СЭМ в обратнорассеянных электронах удалось визуализировать МФБ и КФБ, интернализированные эндотелиальными клетками после четырехчасовой экспозиции. Посредством конфокальной микроскопии выявлено, что состоящие из малорастворимого гидроксиапатита КФБ после интернализации оказываются в лизосомах. МФБ также оказываются в лизосомах, однако детектируются хуже вследствие большей растворимости магний фосфат гидрата. Следовательно, МФБ являются подходящей группой сравнения для оценки специфичности токсического действия КФБ на эндотелий, поскольку данные типы бионов обладают не только близкими физико-химическими свойствами, но и идентично интернализируются эндотелиальными клетками.